基本HTML版本
基因组学与生物技术
(
网络版
), 2014
年
,
第
3
卷
,
第
4-7
页
Jiyinzuxue Yu Shengwu Jishu (Online), 2014, Vol.3, 4-7
http://gb.biopublisher.cn
6
1993)
，并在样品模块制备中加入溶菌酶以利于细
胞裂解这方面做了改进，具体步骤如下：
(1)
将菌种活化于装有
10 ml LB
培养基的指形瓶
中，
30
℃，
230 r/min
，摇床过夜培养。
(2)
转接
1 ml
活化菌液于
20 ml LB
培养基
(250
ml
锥形瓶装
)
中，
30
℃，
230 r/min
，摇床继续培养
至菌液
OD600 nm=0.6
左右。
(3)
将培养液冰上放置
10 min
，
4
℃，
5 000 g
，离
心
30 min
。
(4)
弃上清，沉淀悬浮于
10 ml Solution A
中，洗
涤
1
次，
4
℃，
5 000 g
，离心
10 min
，弃去上清，
沉淀重悬于
1 ml
预冷的
Solution A
中。
(5)
1.6%
的低熔点琼脂糖
(
用
Solution A
配制，加
入溶菌酶至
25 µg/ml)
，保存于
42
℃，与以上得到
的沉淀悬液等量混合后，将混合液转移至模具中，
模具一个孔最大的容量为
80 μL
，将模具置于
4
℃
至凝固。
(6)
把样品模块
(
长
1.0 cm×
宽
0.5 cm×
高
0.1 cm)
置于
4 ml Solution B
中，
50
℃，
150 r/min
，
24 h
。
(7)
用移液枪移去
Solution B
，重新加入
2 ml
ESP
，
50
℃，
150 r/min
，
24 h
。
(8)
再次移去
ESP
液体，加入
2 ml
新的
ESP
，
50
℃，
150 r/min
，
24 h
。
(9)
移去
ESP
液体，模块用
10 ml
含有
1 mM
PMSF
的
TE
缓冲液室温处理
30 min
，重复
1
次。
(10)
用
TE
洗涤模块
3
次
(2 h/
次
)
，将模块保存于
TE
中，
4
℃保存待用。
3.2
制胶上样
制胶按照
CHEF Mapper
系统的操作说明进
行，具体细节如下：
制胶：用微波炉将
100 mL 1%
的
Seakem_Gold
琼脂糖溶解好，冷却至
45
℃左右后，倒入灌胶槽
中，凝固
30 min
。
上样：取出样品块，在已灭菌的枪头和梳子
齿的辅助下，将样品块放入相应的胶孔里，并用
少许
50
℃左右的
1%
的
Seakem Gold
琼脂糖固定样
品块，记录样品顺序。
3.3
电泳
(1)
调节电泳槽平面至水平。
(2)
倒入
0.5×TBE
缓冲液，关上盖子，设置
冷凝泵
参数。
(3)
小心地把胶放入预冷的电泳槽中，盖上盖子。
(4)
使用
Auto Algorithm
程序设置电泳参数。该程
序下可以检测最小分子量为
30 Kb
，最大分子量为
500 Kb
，
1%
凝胶浓度，
14
℃，夹角
120°
，电压梯
度
6 V/cm
，电泳时间
20 h
。
(5)
记录初始转变间隔
2.16 s
，终止转变间隔
44.69 s
，初始电流
146 mA
。
(6)
电泳结束，关机。
(7)
GelRed
染色，拍照并记录实验结果。
4
例证分析
野生
Bt
菌株含有数量丰富的内生质粒，
而大
多数杀虫晶体蛋白大都位于质粒上
。本研究利用
琼脂糖包埋的方法提取
10
个
Bt
菌株的大质粒，
通过脉冲场凝胶电泳
(PFGE)
方法分析大质粒的数
量和分子量大小，结果表明
(
图
1)
，供试的
10
个
菌株含有大质粒的条带数各不相同
(
韩丽珍等
,
2009)
。
图
1 10
个不同
Bt
菌株的大质粒脉冲图谱
注
: M: λDNA ladder; 1: HD-1; 2: 3136-1; 3: 2160-1; 4:
3173-2; 5: 1023-1; 6: 2179-1; 7: 3012-2; 8: 3031-3; 9:
2480-1; 10: Bti; Com.: DNA
压缩区域
Figure 1 PFGE banding patterns of megaplasmid from ten
tested
B.thuringiensis
strains
Note: M: λDNA ladder; 1: HD-1; 2: 3136-1; 3: 2160-1; 4:
3173-2; 5: 1023-1; 6: 2179-1; 7: 3012-2; 8: 3031-3; 9:
2480-1; 10: Bti; Com.: Compression zone for DNA