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基因组学与生物技术
(
网络版
), 2014
年
,
第
3
卷
,
第
4-7
页
Jiyinzuxue Yu Shengwu Jishu (Online), 2014, Vol.3, 4-7
http://gb.biopublisher.cn
5
由于普通的琼脂糖电泳只能分析
DNA
分子
质量小于
25 kb
的
DNA
分子，因此，要分离分子
质量大于
25 kb
的质粒
DNA
分子，理想的选择是
脉冲场凝胶电泳
(Pulsed Field Gel Electrophoresis
，
PFGE)
。
PFGE
是利用两个交变电场交替地开启和
关闭，使
DNA
分子泳动方向随着电场的变化而发
生改变，其独具的高分辨力使其广泛应用于生物
基因组织结构的研究。
我们通过对
10
个
Bt
菌株大质粒的分离鉴定
的基础上提出了本实验方法，利用本
PFGE
实验
方法能对
Bt
菌株质粒的数量、大小以及单个大质
粒的分离获得理想的实验结果。
1
仪器设备及操作
本 研 究 使 用 的 主 要 实 验 仪 器 是 美 国
BIO-RAD
公司的
CHEF Mapper® XA Pulsed Field
Electro- phoresis System
，是目前脉冲场凝胶电泳
中应用最广泛的
CHEF
装置，可分离高达
7 000 kb
的
DNA
分子，包括电泳槽、动力系统、可变速率
泵和冷却系统。该装置有三对电极，提供了一个
相当均一的电场，使凝胶中所有的条带都是直线
前移，从而为针对胶槽边缘及无效电极的扭曲提
供了解决方法。
操作规程如下：
(1)
检查冷凝系统，确认管道连接密封，不漏气。
(2)
在电泳槽中加入约
2.2L
合适体积的电泳缓冲
液。
(3)
接通主机和冷凝泵电源，开启主机开关，主机
自检结束后开启冷凝系统开关按
“set temp”
键调
节需要的电泳温度，按
“actual temp”
显示实际温
度，调节泵的速度为
“100”
左右。
(4)
将加好样的凝胶连同底座一起放入电泳槽内的
黑色背景处，要保证电泳液超过胶面
1-2mm
，将
冷凝泵速度调节至
“50”
，以防凝胶被冲走。
(5)
在主机上设置电泳程序
(
最简单的办法是按
“auto algorithum”
键，设置欲得到的线性范围的最
大和最小
kb
值
，确认所有给出参数
)
，按
“start”
键进行电泳。此时可观察到电泳槽内电极开始出
现气泡。
(6)
电泳开始，
“high voltage”
灯亮，此时切不可打
开电泳槽盖进行操作，以免发生触电危险。
(7)
电泳结束，
“high voltage”
灯灭，依次关掉冷凝
系统、主机开关，然后取出凝胶，最后清除使用
过的电泳液，再用蒸馏水冲洗电泳液循环系统，
晾干。
一般情况下，
1~3
步在电泳前半小时进行。
2
培养基、化学试剂及配置
本实验使用的
Seakem Gold Agarose
由
Cambrex
公司生产
，
Agarose
Ⅲ、十二烷基肌氨
酸钠
(SLS)
、苯甲基磺酰氟
(PMSF)
购于上海生工生
物工程有限公司，氯化钠、乙二胺四乙酸、异丙
醇等购于国内其他生物试剂公司。
(1) LB
培养基配方及制备参照
Zhou
等
(Zhou et al.,
2013)
。
(2) Solution A: 2 M Nacl 50 mL, 100 mM Tris-cl
(pH 7.5)50 mL
(3) Solution B: 10 mM EDTA(pH 8.0); 25 mM
Tris-cl (pH 8.0); 2% Lysozyme; 75 μg/mL RNAase
(4) ESP: 0.5 M EDTA (pH 8.0); 1% SLS; 1 mg/mL
蛋白酶
K
(5) TE (
含
1 mM PMSF): 10 mM Tris-cl (pH 7.5); 1
mM EDTA (pH 8.0); 1 mM PMSF
(6) TE: 10 mM Tris-cl (pH 7.5); 1 mM EDTA (pH
8.0)
(7) 10 mM PMSF: 1 mg PMSF
溶于
1mL
异丙醇
中，分装并放于
-20
℃储存
(
注意
: PMSF,
剧毒
,
小
心使用
)
。
(8) 10× TBE Buffer: 108 g Tris
碱
; 55 g
硼酸
;
40 mL 0.5M EDTA, pH 8.0
(9) Agarose
Ⅲ
(
脉冲场电泳琼脂糖
)
：用电泳缓冲
液配制成
1%
的凝胶，微波炉中加热使其溶解
(10) Seakem Gold Agarose:
使用浓度为
1%
，配制
方法同
9
3
实验流程
3.1
琼脂糖包埋法提取大质粒
参考
Carlson
方法
(Cathrine and Anne-Brit,